Mikropreparáty štírků
Napsal: 17 pro 2012, 17:48
Protože mě v posledních dnech poptali dva členové na štírky, tak tady dávám aktualizovaný postup (původní byl na starém fóru). Postup je použitelný pro všechny malé brebery, jen je třeba upravit časy, ty uvádím pro průměrného cca 3 mm štírka:
Trvalé mikropreparáty
- uložené jedince z 70% alkoholu nebo 70% alkoholu s 20% glycerolu vyprat v 80% -85% alkoholu (asi 20 - 30 minut)
- - exempláře je třeba srovnat do polohy, v jaké budou v preparátu (levá palpa vrškem, pravá spodkem, nohy co nejdále od sebe), v další fázi ztuhnou a zkřehnou a další manipulace je nemožná
- přibližně 95% alkohol, odvodněný vypálenou modrou skalicí (20 - 30 minut).
- odvodnění ve větší kapce Loctite 7458 (2 - 5 minut), alternativně je možné použít terpinol, xylen nebo aceton v čistotě PA (10 minut)
- odsátí odvodňovacího média malou inj. stříkačkou nebo filtračním papírem (použitá kapka L7458 je opakovaně použitelná až 10x)
- na podložní sklíčko s aktivátorem kapnout kapku lepidla a do ní umístit objekt
- zakrýt krycím sklíčkem s aktivátorem a kapkou lepidla. Bublinky se většinou nevytvářejí, lepidlo je velice řídké. Je třeba pracovat velice rychle, lepidlo začíná polymerovat ve styku s moderátorem a dostupný čas je do 30 sekund!
- preparát je třeba nechat nejméně 10 minut v horizontální poloze (dosažení technické fixace), plná polymerace proběhne během 24 hodin
*** Celý proces odvodnění je možné provádět v malých skleněných embriomiskách nebo na podložních sklíčkách s jamkou zakrytých proti odpařování krycím sklíčkem.
*** Pro manipulaci s krycími sklíčky jsou vynikající plastické lepící čtverečky Henkel PRITT FIX-IT nebo podobné (v papírnictví, pryžovité lepící polštářky na plakáty). Krycí sklíčko s přilepeným válečkem udělaným z půlky válečku se snadno uchopí prsty nebo pinzetou. Na sklíčku ho nechávám jako zátěž do vytvrzení lepidla. Na skle nezanechává žádné stopy, jiné druhy nechávají slabý mastný povrch, snadno se ale čistí např. xylenem.
Používaná kyanoakrylátová lepidla: Loctite 401 nebo Loctite 403 (L401 má nižší viskozitu a má snahu vytékat; vhodné pro preparáty do výšky lepidla 0.15 mm -dostatečné pro většinu evropských druhů, pro vyšší preparáty stačí podložit sklíčka rybářským vlascem, L403 je vhodné na vyšší preparáty až do 0.25 mm bez podložení). Index lomu 1.468 až 1.476. Oba druhy vteřinových lepidel jsou čirá až světle žlutá (v preparátu není zřetelné), po úplné polymeraci se v čase nemění (výrobcem udávaná trvanlivost až 250 let).
Podložní sklíčka v místě preparátu a krycí sklíčka je nutné potřít aktivátorem Loctite 7458, zlepšuje a zrychluje polymeraci uvnitř preparátu. Aktivátor je třeba nechat alespoň 3 minut zaschnout. Je možné připravit sklíčka dopředu, zaschlý aktivátor si zachovává účinnost 12 - 24 hodin.
Při manipulaci s vteřinovými lepidly doporučuju latexové chirurgické rukavice. Není problém se přilepit ke stolu!
V případě potřeby preparát rozmontovat, stačí ponořit přes noc do Loctite Decaploc 55, stejný přípravek se používá na čištění lepidla z nástrojů, stolu a rukou.
Loctite 401 - http://www.loctite.as/?p=productsMore&i ... ve-lepidlo
Loctite 403 - http://www.loctite.as/?p=productsMore&i ... ve-lepidlo
Loctite 7458 - http://www.loctite.as/?p=productsMore&i ... -aktivator
Loctite Decaploc 55 - http://www.loctite.as/?p=productsMore&i ... ni-lepidla
Pokud je třeba exempláře do mikropreparátů odbarvit a projasnit, provádí se to v první fázi:
- odbarvení a projasnění tmavých exemplářů macerací v 10% K2CO3 - ponechat v lázni do odbarvení (12 - 24 hodin). Použití KOH vede zpravidla ke ztrátě trichobotrií a set na těle. Další možností je nasycený roztok KOH v 4% proxydu vodíku (roztok je třeba připravit vždy nový, odbarvení probíhá velmi rychle, 15 -20 minut, někdy se tvoří uvnitř preparátu bublinky :-(. Po odbarvení je třeba vyprat objekt 10 - 15 minut ve vodě s 5% - 10% kyseliny octové a vrátit aspoň na 30 minut do 70% alkoholu (při barvení je s tím třeba počítat! a mírně přebarvovat, zvlášť kongem a metylénovou modří)
- k barvení jsou vhodná barviva a postupy (podle vhodnosti): stříbření, eriochromová čerň, kongo červeň, safranin + světlá zeleň, metylénová modř
- - Stříbření zvýrazní povrchové struktury a sety. Postup je následující:
Potřeby:
lugolův roztok - jodjodkalium (lékárna)
AgNO3 - 10 % roztok
tekutá vývojka AGFA Rodinal (prodává se pod mnoha různými názvy)
destilovaná deionizovaná voda
Postup:
objekt se nechá 10 - 15 minut v lugolove roztoku, opláchne vodou a převede do AgNO3 (ve tmě!) na 15 minut, exponuje se v kapce vody pod silnou žárovkou (expozice ) asi 2 - 5 minut (vyzkoušet !, objekt má být světle šedý), vyvolává se asi 90 vteřin v Rodinalu v ředění 1:3 , promyje se a převede zpět do 70 % alkoholu. Přebarvený objekt se dá zeslabit lugolem.
Dočasné preparáty:
- v kyselině mléčné pod krycím sklíčkem, počkat několik minut do projasnění
- v glycerolu
- - v obou médiích je možné objekty dobarvovat přímo v médiu rozpuštěnou kongo červení nebo metylénovou modří
Po zpracování se objekty bez dalších postupů převedou zpět do 70% alkoholu
V literatuře jsou doporučovaná média pro trvalé preparáty na bázi laktofenolu a chloralhydrátu. Tato média jsou vzhledem ke sklonům ke krystalizaci nevhodná. Jedinou alternativou je klasické zalévání do kanadského balzámu.
Trvalé mikropreparáty
- uložené jedince z 70% alkoholu nebo 70% alkoholu s 20% glycerolu vyprat v 80% -85% alkoholu (asi 20 - 30 minut)
- - exempláře je třeba srovnat do polohy, v jaké budou v preparátu (levá palpa vrškem, pravá spodkem, nohy co nejdále od sebe), v další fázi ztuhnou a zkřehnou a další manipulace je nemožná
- přibližně 95% alkohol, odvodněný vypálenou modrou skalicí (20 - 30 minut).
- odvodnění ve větší kapce Loctite 7458 (2 - 5 minut), alternativně je možné použít terpinol, xylen nebo aceton v čistotě PA (10 minut)
- odsátí odvodňovacího média malou inj. stříkačkou nebo filtračním papírem (použitá kapka L7458 je opakovaně použitelná až 10x)
- na podložní sklíčko s aktivátorem kapnout kapku lepidla a do ní umístit objekt
- zakrýt krycím sklíčkem s aktivátorem a kapkou lepidla. Bublinky se většinou nevytvářejí, lepidlo je velice řídké. Je třeba pracovat velice rychle, lepidlo začíná polymerovat ve styku s moderátorem a dostupný čas je do 30 sekund!
- preparát je třeba nechat nejméně 10 minut v horizontální poloze (dosažení technické fixace), plná polymerace proběhne během 24 hodin
*** Celý proces odvodnění je možné provádět v malých skleněných embriomiskách nebo na podložních sklíčkách s jamkou zakrytých proti odpařování krycím sklíčkem.
*** Pro manipulaci s krycími sklíčky jsou vynikající plastické lepící čtverečky Henkel PRITT FIX-IT nebo podobné (v papírnictví, pryžovité lepící polštářky na plakáty). Krycí sklíčko s přilepeným válečkem udělaným z půlky válečku se snadno uchopí prsty nebo pinzetou. Na sklíčku ho nechávám jako zátěž do vytvrzení lepidla. Na skle nezanechává žádné stopy, jiné druhy nechávají slabý mastný povrch, snadno se ale čistí např. xylenem.
Používaná kyanoakrylátová lepidla: Loctite 401 nebo Loctite 403 (L401 má nižší viskozitu a má snahu vytékat; vhodné pro preparáty do výšky lepidla 0.15 mm -dostatečné pro většinu evropských druhů, pro vyšší preparáty stačí podložit sklíčka rybářským vlascem, L403 je vhodné na vyšší preparáty až do 0.25 mm bez podložení). Index lomu 1.468 až 1.476. Oba druhy vteřinových lepidel jsou čirá až světle žlutá (v preparátu není zřetelné), po úplné polymeraci se v čase nemění (výrobcem udávaná trvanlivost až 250 let).
Podložní sklíčka v místě preparátu a krycí sklíčka je nutné potřít aktivátorem Loctite 7458, zlepšuje a zrychluje polymeraci uvnitř preparátu. Aktivátor je třeba nechat alespoň 3 minut zaschnout. Je možné připravit sklíčka dopředu, zaschlý aktivátor si zachovává účinnost 12 - 24 hodin.
Při manipulaci s vteřinovými lepidly doporučuju latexové chirurgické rukavice. Není problém se přilepit ke stolu!
V případě potřeby preparát rozmontovat, stačí ponořit přes noc do Loctite Decaploc 55, stejný přípravek se používá na čištění lepidla z nástrojů, stolu a rukou.
Loctite 401 - http://www.loctite.as/?p=productsMore&i ... ve-lepidlo
Loctite 403 - http://www.loctite.as/?p=productsMore&i ... ve-lepidlo
Loctite 7458 - http://www.loctite.as/?p=productsMore&i ... -aktivator
Loctite Decaploc 55 - http://www.loctite.as/?p=productsMore&i ... ni-lepidla
Pokud je třeba exempláře do mikropreparátů odbarvit a projasnit, provádí se to v první fázi:
- odbarvení a projasnění tmavých exemplářů macerací v 10% K2CO3 - ponechat v lázni do odbarvení (12 - 24 hodin). Použití KOH vede zpravidla ke ztrátě trichobotrií a set na těle. Další možností je nasycený roztok KOH v 4% proxydu vodíku (roztok je třeba připravit vždy nový, odbarvení probíhá velmi rychle, 15 -20 minut, někdy se tvoří uvnitř preparátu bublinky :-(. Po odbarvení je třeba vyprat objekt 10 - 15 minut ve vodě s 5% - 10% kyseliny octové a vrátit aspoň na 30 minut do 70% alkoholu (při barvení je s tím třeba počítat! a mírně přebarvovat, zvlášť kongem a metylénovou modří)
- k barvení jsou vhodná barviva a postupy (podle vhodnosti): stříbření, eriochromová čerň, kongo červeň, safranin + světlá zeleň, metylénová modř
- - Stříbření zvýrazní povrchové struktury a sety. Postup je následující:
Potřeby:
lugolův roztok - jodjodkalium (lékárna)
AgNO3 - 10 % roztok
tekutá vývojka AGFA Rodinal (prodává se pod mnoha různými názvy)
destilovaná deionizovaná voda
Postup:
objekt se nechá 10 - 15 minut v lugolove roztoku, opláchne vodou a převede do AgNO3 (ve tmě!) na 15 minut, exponuje se v kapce vody pod silnou žárovkou (expozice ) asi 2 - 5 minut (vyzkoušet !, objekt má být světle šedý), vyvolává se asi 90 vteřin v Rodinalu v ředění 1:3 , promyje se a převede zpět do 70 % alkoholu. Přebarvený objekt se dá zeslabit lugolem.
Dočasné preparáty:
- v kyselině mléčné pod krycím sklíčkem, počkat několik minut do projasnění
- v glycerolu
- - v obou médiích je možné objekty dobarvovat přímo v médiu rozpuštěnou kongo červení nebo metylénovou modří
Po zpracování se objekty bez dalších postupů převedou zpět do 70% alkoholu
V literatuře jsou doporučovaná média pro trvalé preparáty na bázi laktofenolu a chloralhydrátu. Tato média jsou vzhledem ke sklonům ke krystalizaci nevhodná. Jedinou alternativou je klasické zalévání do kanadského balzámu.
Solakryl je kopolymer butylmetakrylátu s metylmetakrylátem rozpuštěným v xylenu a s metakrylátama nemám dobrou zkušenost ani v tom, že po čase žloutnou,to je vidět ve větší vrstvě a štírci se zalévají do Mnohonásobně větší vrstvy, než hystologické řezy. Taky životnost kyanoakrylátů je několikanásobně větší a to nemluvim o indexu lomu - 1.42 x 1.47, a to už je při potřebě vidět kdejaký chlup docela znát. Proces zalévání je v podstatě stejný, nic se nezjednoduší - odvodnit lihem, odvodnit v tomhle případě xylenem a zalít x odvodnit lihem, převést do 7458 a zalít. A já všechno dělám v destičkách na tkáňové kultury, které jsou z polystyrenu a xylen by mi je sežral.
